Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) ist eine spezialisierte Form der Flüssigkeitschromatographie, die weit verbreitet für die Analyse und Reinigung von Proteinen und anderen biologischen Makromolekülen verwendet wird. Ursprünglich 1982 von Pharmacia entwickelt, wurde FPLC als eine Technik der mittleren Druckchromatographie konzipiert, die für Biomoleküle, insbesondere Proteine, optimiert ist, die empfindlich auf extreme Bedingungen wie hohen Druck, extreme pH-Werte und organische Lösungsmittel reagieren.
Prinzipien und Mechanismus
FPLC trennt die Komponenten eines Gemisches basierend auf ihren unterschiedlichen Affinitäten zwischen einer mobilen Phase und einer stationären Phase. Die mobile Phase in FPLC ist eine wässrige Pufferlösung, deren Durchflussrate präzise von einer Positiv-Displacement-Pumpe gesteuert wird, die in der Regel bei 1–5 mL/min unter niedrigem Druck (unter 5 bar) gehalten wird. Die stationäre Phase besteht aus porösen Harzperlen, die oft vernetztes Agarose sind, und in Kolonnen gepackt werden. Diese Perlen variieren in Größe und Oberflächenchemie je nach Art der benötigten Trennung.
Anwendungen
- Reinigung von rekombinanten Proteinen, Antikörpern und Enzymen.
- Isolation von Nukleinsäuren wie Oligonukleotiden und Plasmiden.
- Vorbereitung von Proteinen für strukturelle und funktionelle Studien.
- Entfernung von Kontaminanten wie Endotoxinen aus Proteinpräparationen.
Vorteile
- Sanfte Betriebsbedingungen: Niedriger Druck und wässrige Puffersysteme verhindern die Denaturierung von Proteinen.
- Hohe Auflösung und Reproduzierbarkeit: Kleine Perlen und präzise Durchflusskontrolle verbessern die Trennqualität.
- Automatisierung: Erleichtert Gradient-Elution, Probenhandhabung und Fraktionssammlung.
- Skalierbarkeit: Geeignet für die analytische, präparative oder industrielle Reinigung.
- Vielseitigkeit: Kompatibel mit verschiedenen chromatographischen Modi und biologischen Probentypen.
FPLC stellt eine grundlegende Technik in der Proteinbiochemie und Molekularbiologie dar, die eine robuste, sanfte und vielseitige Plattform für die Reinigung und Analyse von Proteinen bietet. Ihre Entwicklung hat die Produktion von hochreinen Proteinen, die für die Forschung, Diagnostik und therapeutische Anwendungen unerlässlich sind, erheblich erleichtert.
