Allgemeines Protokoll für die Durchflusszytometrie

I. Erforderliche Materialien
Reagenzien
- Ein (oder mehrere) Iaire Antikörper, die gekoppelt oder ungekoppelt und spezifisch für Ihr(e) Molekül(e) von Interesse sind.
- Ein Fc-Rezeptorblocker oder "Anti-CD16/32, block Fc binding", der den primären Antikörper auf unspezifische Weise bindet.
- Ein sekundärer Antikörper, im Falle indirekter Markierungen mit einem ungekoppelten primären Ac
- Eine (oder mehrere) nicht relevante Kontroll-Isotypen von Isotypen und Kopplungen, die mit denen der primären Antikörper identisch sind
Stempel
- Ein Markierungspuffer für die Durchflusszytometrie oder "Staining Buffer".
- Trypanblau für die Zellzählung oder "Trypan blue".
- Hülsenflüssigkeit für das Durchflusszytometer

Material - Pipetten und ein Pipet-aid
- Eine Zentrifuge
- Ein Kühlschrank oder Eis
- Ein Durchflusszytometer


II. Dauer des Experiments
- 30 min Vorbereitung der Proben und des Antikörpers (Verdünnungen)
- 30 min bis 1 h Inkubation der Antikörper, je nach verwendeter Strategie (direkte oder indirekte Markierung)
- 30 min bis 1 h Ablesen der Zellen mit dem Durchflusszytometer (abhängig von der Anzahl der Proben, der Zellkonzentration und den Einstellungen des Zytometers)
- TOTAL: 2 bis 3 Stunden


III. Vorgehensweise
- Verdünnen Sie den primären Antikörper und die Isotyp-Kontrolle mit 50 µl Reaktionspuffer, um die gewünschte Konzentration zu erhalten, die zuvor durch eine Titration validiert wurde (für beide Ak identisch).
- Inkubieren Sie 50 µl des Zellpräparats mit 50 µl des Iaire Antikörperpräparats oder der Isotyp-Kontrolle in einer 96-Well-Platte mit U-Boden.
- Schüttle die Platte vorsichtig und inkubiere für 15-30 min bei 4°C und im Dunkeln.

Hinweis : Antikörper haben unterschiedliche Affinitäten zu ihrem Antigen und benötigen unterschiedliche Inkubationszeiten, die im Vorfeld optimiert werden müssen.

- Geben Sie 200 µl Reaktionspuffer hinzu, um die Reaktion zu stoppen
- Zentrifugiere die Zellsuspension für 5 min (300 - 400g) bei +4°C und entferne den Überstand.
- Zweimalige Wiederholung der Zellwäschen mit 200 µl Reaktionspuffer und Zentrifugation der Zellsuspension für 5 min (300 - 400g) bei 4°c.

Fakultativ: Bei indirekter Markierung wiederholen Sie die Markierungsschritte mit dem sekundären Antikörper mit demselben Protokoll und denselben Beobachtungen
- In 500 µl Reaktionspuffer oder Fixierpuffer mit 2% Formaldehyd resuspendieren.
- Lesen Sie markierte Zellen im Durchflusszytometer ab

IV. Suchmaschinen
- Primäre Antikörper
- Sekundäre Antikörper, bei indirekten Markierungen mit einem ungekoppelten Ac Iaire