NeoLux; Viability assessment by loss of efflux protein function

La technologie brevetée NeoLUX est un test de cellules vivantes qui mesure l'état d'homéostasie ou de dommage cellulaire par lecture de fluorescence. La technologie a été optimisée pour un débit élevé sur des plaques à 96 et 384 puits, adaptées aux lecteurs de fluorescence commerciaux, selon un protocole très simple limité à l'ajout du marqueur fluorescent dans le milieu de culture et à deux mesures de fluorescence.
La technologie NeoLUX est basée sur la photo-induction d'un biocapteur conduisant à un signal de fluorescence. Cette augmentation de la fluorescence n'est observée que sur les cellules en homéostasie avant l'ajout du biocapteur. Le calcul des rapports de fluorescence avant et après l'application de la LED permet de mesurer avec précision et en fonction de la dose l'état des dommages cellulaires consécutifs à la toxicité chimique ou physique induite par l'échantillon.

Méthode d'essai NeoLUX: Principe

La procédure expérimentale est simple. Le biocapteur TO est ajouté au milieu de culture cellulaire et devient fluorescent après association avec les acides nucléiques cellulaires. Lorsque le TO est photoactivé par une illumination LED à 480 nm, sa relaxation s'accompagne d'un transfert d'énergie vers la molécule intracellulaire de dioxygène (³O₂) , ce qui entraîne la production d'oxygène singulet (¹O₂) et une cascade de production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), y compris l'anion superoxyde (O₂^.-) et le radical hydroxyle (OH^.) (voir fig. 1). L'effet antioxydant d'une substance peut alors être mesuré par sa capacité à contrecarrer cette production intracellulaire de ROS.

Courbes dose-effet 

L'effet antioxydant intracellulaire est révélé par un délai dans l'augmentation de la fluorescence déclenchée par la photo-activation du TO dépendante de la LED. La figure 2 illustre les profils de fluorescence de cellules HepG2 humaines traitées pendant 4 heures à différentes concentrations de resvératrol. Le resvératrol est un puissant antioxydant cellulaire connu pour être actif à la fois comme piégeur de ROS et comme inducteur de la défense naturelle des cellules pilotée par la voie Nrf2. La courbe du contrôle (non traité) est illustrée en noir. Les différences entre l'aire sous la courbe (AUC) du contrôle et celle de l'échantillon permettent d'établir un indice qui qualifie l'effet antioxydant intracellulaire de l'échantillon.

EC₅₀ et autres paramètres révélant des effets antioxydants

Le calcul de l'indice NeoLUX à différentes concentrations de l'échantillon permet d'établir des profils dose-effet qui s'ajustent bien à la régression sigmoïde, permettant l'évaluation de l'EC₁₀ (Efficacy Concentration 10%, seuil de l'effet cellulaire), de l'EC₅₀ standard (Efficacy Concentration 50%) et de l'EC₉₀ (Efficacy Concentration 90%, dose la plus faible à laquelle le composé agit avec un effet maximal). La figure 3 illustre un exemple de courbes dose-effet obtenues après traitement au resvératrol pendant 1 et 4 h sur des cellules humaines HepG2.

NeoLUX : une méthode d'essai aux multiples facettes

Plus généralement, les profils de fluorescence NeoLUX fournissent des informations sur plusieurs paramètres spécifiques à l'échantillon testé et au modèle cellulaire choisi. Outre l'effet antioxydant décrit ci-dessus, le test NeoLUX met en évidence les effets pro-oxydants (déplacement vers la gauche du profil de l'échantillon) et les effets cytotoxiques (la fluorescence initiale est élevée et l'illumination reste inefficace) (figure 4), ce qui apporte une valeur ajoutée à la méthode. Il convient également de noter que la technologie NeoLUX fonctionne sur tout type de modèle cellulaire eucaryote (animal, végétal, fongique) et procaryote (bactérie).

Caractéristiques :

• Pour 1000 ou 4000 points de mesure dans des plaques à 96 puits
• Procédure en une étape
• Pas de lavage
• Procédure standard pour la plupart des lignées cellulaires (kit d'optimisation disponible si nécessaire)
• Adaptée aux lignées cellulaires, hiPSCs, cellules primaires,...
• 1 solution dans le kit (biocapteur à diluer dans le milieu de culture)
• Stockage à 4°C
• Délai d'expiration : 6 mois
• Egalement disponible pour les plaques 384 puits.

Mécanisme

Le processus est appelé système de cellules lumineuses car le niveau de fluorescence du biocapteur fluorescent augmente au cours de sa photo-induction par illumination. Le biocapteur pénètre passivement dans les cellules mais est rapidement éliminé des cellules fonctionnelles par les protéines de transport d'efflux, ce qui se traduit par un faible signal fluorescent. Lorsque la lumière est appliquée, la photo-induction du biocapteur génère des ROS intracellulaires, qui modifient l'homéostasie cellulaire ou la capacité de la cellule à libérer le biocapteur, déclenchant son entrée massive dans les cellules et entraînant une augmentation du signal de fluorescence. Si les cellules ont été précédemment incubées avec une substance toxique, provoquant une altération de l'efflux ou d'autres fonctions cellulaires, le biocapteur entre massivement, entraînant un signal de fluorescence élevé qui n'augmente pas après l'application de lumière.

Sécurité

Ce produit est destiné uniquement à la recherche et non à un usage humain ou thérapeutique. Potentiellement dangereux. Éviter l'exposition prolongée ou répétée. Éviter tout contact avec les yeux, la peau ou les vêtements. Se laver soigneusement après manipulation. En cas de contact avec les yeux ou la peau, laver les zones affectées à grande eau pendant 15 minutes et consulter un médecin. En cas d'inhalation ou d'ingestion, déplacer la personne à l'air frais et consulter immédiatement un médecin.

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