La RT-qPCR en deux étapes implique deux réactions distinctes dans deux tubes différents. La première étape consiste en une synthèse de l'ADNc du premier brin (transcription inverse - RT). Puis la seconde est une amplification d'une partie de l'ADNc résultant par PCR quantitative dans un tube séparé. Par conséquent, la RT-qPCR en deux étapes est utile pour détecter de multiples gènes dans un seul échantillon d'ARN. La séparation des réactions de RT et de PCR quantitative permet d'optimiser les conditions réactionnelles pour chaque étape ainsi que la souplesse avec l'amorçage par transcription inverse (amorces oligo (dT), hexamères aléatoires ou amorces spécifiques de gènes) et PCR quantitative (par exemple choix d'ADN polymérase et des composants PCR). Comparés à la RT-qPCR en une étape, les inconvénients de la RT-qPCR en deux étapes incluent plusieurs étapes pour un flux de travail étendu, une manipulation et un traitement supplémentaires de l'échantillon, et augmentent les risques de contamination et de variation des résultats.