La combinaison du NBT (nitro blue tetrazolium chloride) et du BCIP (5-brom-4-chloro-3'-indolyphosphate p-toluidine salt) permet d'obtenir un précipité insoluble violet noir intense lorsqu'elle réagit avec la phosphatase alcaline, une enzyme très utilisée pour les immunoessais tels que l'IHC, le WB ou l'ELISA.

Ces substrats permettent donc la détection de l'activité de la phosphatase alcaline sur milieu solide comme les membranes de nitrocellulose ou les coupes de tissus.

Le précipité produit est partiellement insoluble dans l'alcool. Cette combinaison de substrat est plus sensible que d'autres substrats de la phosphatase alcaline comme le AP-Red ou le AP-Blue.