La chromatographie liquide rapide sur colonne (FPLC) est une forme spécialisée de chromatographie liquide largement utilisée pour l’analyse et la purification des protéines et autres macromolécules biologiques. Développée à l'origine par Pharmacia en 1982, la FPLC a été conçue comme une technique chromatographique à pression moyenne optimisée pour les biomolécules, notamment les protéines, qui sont sensibles aux conditions extrêmes telles que la haute pression, le pH extrême et les solvants organiques.
Principes et Mécanisme
La FPLC sépare les composants d'un mélange en fonction de leurs affinités différentielles entre une phase mobile et une phase stationnaire. La phase mobile en FPLC est une solution tampon aqueuse, dont le débit est précisément contrôlé par une pompe à déplacement positif, généralement maintenue entre 1 et 5 mL/min sous faible pression (inférieure à 5 bar). La phase stationnaire est constituée de billes de résine poreuse, souvent de l'agarose réticulée, disposées dans des colonnes. Ces billes varient en taille et en chimie de surface en fonction du type de séparation requis.
Applications
- Purification des protéines recombinantes, des anticorps et des enzymes.
- Isolation des acides nucléiques tels que les oligonucléotides et les plasmides.
- Préparation des protéines pour des études structurales et fonctionnelles.
- Élimination des contaminants tels que les endotoxines dans les préparations protéiques.
Avantages
- Conditions de fonctionnement douces : La faible pression et les tampons aqueux empêchent la dénaturation des protéines.
- Haute résolution et reproductibilité : La petite taille des billes et le contrôle précis du débit améliorent la qualité de la séparation.
- Automatisation : Facilite l'élution par gradient, la gestion des échantillons et la collecte des fractions.
- Scalabilité : Convient pour la purification à l'échelle analytique, préparative ou industrielle.
- Polyvalence : Compatible avec de multiples modes chromatographiques et types d'échantillons biologiques.
La FPLC représente une technique fondamentale en biochimie des protéines et en biologie moléculaire, offrant une plateforme robuste, douce et polyvalente pour la purification et l'analyse des protéines. Son développement a grandement facilité la production de protéines de haute pureté, essentielles pour la recherche, les diagnostics et les applications thérapeutiques.
