Protocole pour le western blot

Le Western blot est une technique largement utilisée pour détecter des protéines spécifiques dans des échantillons biologiques complexes. Cette méthode implique la séparation des protéines par SDS-PAGE, leur transfert sur une membrane et leur détection à l'aide d'anticorps. Il s'agit d'un outil essentiel en biologie moléculaire et en recherche biomédicale pour l'analyse de l'expression, des modifications et des interactions des protéines.

Protocole Étape par Étape

1- Préparation des Échantillons

Avant d’effectuer un Western blot, il est nécessaire de s’assurer que la protéine d’intérêt est disponible pour la liaison aux anticorps. Cela implique généralement la préparation d’un lysat afin de libérer la protéine des cellules ou des tissus. Le lysat peut être divisé en plusieurs aliquotes, mélangé avec un tampon de chargement et stocké à -80°C jusqu'à son utilisation.

- Lyser les cellules ou tissus en utilisant un tampon RIPA, complété par des inhibiteurs de protéases et des inhibiteurs de phosphatases.

- Soniquer ou vortexer les échantillons pour assurer une lyse complète.

- Centrifuger à 16 000 g pendant 20 minutes à 4°C pour éliminer les débris.

- Transférer le surnageant dans un nouveau tube et mesurer la concentration en protéines à l’aide d’un dosage BCA ou Bradford.

2- Électrophorèse SDS-PAGE

Le gel est immergé dans un tampon, les échantillons de protéines sont chargés, et un courant électrique est appliqué, ce qui entraîne la migration des protéines d’une extrémité du gel (électrode négative) vers l’autre (électrode positive). Les protéines sont séparées en fonction de leur taille : les plus petites migrent plus rapidement à travers le gel et apparaissent donc plus bas. Afin de confirmer la taille de chaque protéine, les échantillons sont chargés aux côtés d’échelles de poids moléculaire.

- Préparer un gel de séparation en polyacrylamide à 10–15% et un gel de concentration à 4%.

- Mélanger 20 µg d’échantillon protéique avec un tampon Laemmli.

- Faire bouillir pendant 5 minutes à 95°C, puis centrifuger les tubes.

- Charger un volume égal de protéines dans les puits du gel SDS-PAGE (la concentration d’acrylamide dépend de la taille de la protéine cible), en incluant un puits pour les marqueurs de poids moléculaire.

- Effectuer la migration à intensité constante avec un tampon approprié.

3- Transfert des Protéines du Gel vers la Membrane

Une fois l’électrophorèse terminée, les protéines sont transférées (ou « blotées ») sur une membrane pour l’incubation avec les anticorps. La membrane peut être en nitrocellulose ou en polyfluorure de vinylidène (PVDF), deux options adaptées. Comme pour l’électrophorèse, le transfert repose sur une charge électrique facilitant la migration des protéines du gel vers l’électrode positive, où elles adhèrent à la membrane.

- Découper la membrane à la taille du gel et activer les membranes PVDF avec du méthanol (non requis pour la nitrocellulose).

- Assembler le sandwich de transfert :

- Réaliser le transfert en utilisant:

• Transfert humide : 100V pendant 60-90 min à 4°C.
• Transfert à l'état semi sec : 20V pendant 30-60 min.
• Transfert à sec : Suivre les instructions du fabricant.

Before proceeding, you can check the protein has successfully transferred to the membrane. You can check the success of the transfer using Coomassie blue (Immerse the membrane in Coomassie Blue stain for 5–10 minutes) and Ponceau S (Briefly incubate the membrane in Ponceau S solution for 1–2 minutes) staining of the gel. Rince off the membrane and incubate in blocking solution. You can use the pre-stained molecular weight ladder as an initial check to compare the amount of protein on the PAGE gel and the membrane.

Avant de poursuivre, vous pouvez vérifier que la protéine a été transférée avec succès sur la membrane. Vous pouvez vérifier le succès du transfert en utilisant le bleu de Coomassie (immerger la membrane dans le colorant bleu de Coomassie pendant 5-10 minutes) et le Ponceau S (incuber brièvement la membrane dans la solution de Ponceau S pendant 1-2 minutes) pour colorer le gel. Retirer la membrane et l'incuber dans une solution de blocage. Vous pouvez utiliser l'échelle de poids moléculaire pré-colorée comme contrôle initial pour comparer la quantité de protéines sur le gel PAGE et sur la membrane.

4- Incubation et révélation des anticorps

- Incuber la membrane dans 5 % de BSA dans du TBST pendant 1 heure à température ambiante.

- Incuber avec l'anticorps primaire (dilué dans le tampon de blocage) pendant une nuit à 4°C en agitant légèrement.

- Laver la membrane 3 à 5 fois avec du TBST (5 minutes par lavage).

- Incuber avec l'anticorps secondaire pendant 1 heure à température ambiante.

- Laver à nouveau la membrane 3 à 5 fois avec du TBST.

- Appliquer le substrat sur le blot.

Les blots peuvent être imagés immédiatement lorsqu'ils sont encore humides ou peuvent être séchés avant l'imagerie. Placer chaque blot dans une feuille de protection ou sur une surface propre avant l'imagerie afin d'éviter toute contamination.