NeoLux; Viability assessment by loss of efflux protein function

La tecnologia brevettata NeoLUX è un test cellulare che misura lo stato di omeostasi o di danno cellulare mediante lettura di fluorescenza. La tecnologia è stata ottimizzata per un'elevata produttività su piastre a 96 e 384 pozzetti, adatte ai lettori di fluorescenza commerciali, secondo un protocollo molto semplice che si limita all'aggiunta del marcatore fluorescente nel terreno di coltura e a due misurazioni di fluorescenza.

La tecnologia NeoLUX si basa sulla fotoinduzione di un biosensore che porta a un segnale di fluorescenza. Questo aumento di fluorescenza si osserva solo sulle cellule in omeostasi prima dell'aggiunta del biosensore. Il calcolo dei rapporti di fluorescenza prima e dopo l'applicazione del LED porta a una misurazione accurata e dose-dipendente dello stato di danno cellulare che segue la tossicità chimica o fisica indotta dal campione.

Principio del metodo di test NeoLux

La procedura sperimentale è semplice. Il biosensore TO viene aggiunto al terreno di coltura cellulare e diventa fluorescente dopo l'associazione con gli acidi nucleici cellulari. Quando il TO viene fotoattivato dall'illuminazione LED a 480 nm, il suo rilassamento è accompagnato da un trasferimento di energia alla molecola intracellulare di diossigeno (3O2) con conseguente produzione di ossigeno singoletto (1O2) e una cascata di produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), tra cui l'anione superossido (O2.-) e il radicale idrossile (OH.) (vedi fig. 1). L'effetto antiossidante di una sostanza può quindi essere misurato in base alla sua capacità di contrastare questa produzione intracellulare di ROS.

Curve dose-effetto 

L'effetto antiossidante intracellulare è rivelato da un ritardo temporale nell'aumento della fluorescenza innescato dalla fotoattivazione LED-dipendente della TO. La Figura 2 illustra i profili di fluorescenza di cellule umane HepG2 trattate per 4 ore con diverse concentrazioni di resveratrolo. Il resveratrolo è un potente antiossidante cellulare noto per essere attivo sia come scavenger di ROS sia come induttore della difesa naturale delle cellule guidata dalla via Nrf2. La curva di controllo (non trattata) è illustrata in nero. Le differenze tra le aree sotto le curve (AUC) del controllo e del campione consentono di stabilire un indice che qualifica l'effetto antiossidante intracellulare del campione.

EC50 e altri parametri che rivelano gli effetti antiossidanti

Il calcolo dell'indice NeoLux a diverse concentrazioni del campione permette di stabilire profili dose-effetto che si adattano bene alla regressione sigmoidea, consentendo di valutare l'EC10 (Efficacy Concentration 10%, soglia dell'effetto cellulare), l'EC50 standard (Efficacy Concentration 50%) e l'EC90 (Efficacy Concentration 90%, dose più debole alla quale il composto agisce con un effetto massimo). La Figura 3 illustra un esempio di curve dose-effetto ottenute dopo il trattamento con resveratrolo per 1 e 4 ore su cellule umane HepG2.

NeoLux: un metodo di analisi poliedrico

Più in generale, i profili di fluorescenza NeoLux forniscono informazioni su diversi parametri specifici del campione analizzato e del modello cellulare scelto. Oltre all'effetto antiossidante descritto in precedenza, il test NeoLux evidenzia gli effetti pro-ossidanti (spostamento a sinistra del profilo del campione) e gli effetti citotossici (la fluorescenza iniziale è elevata e l'illuminazione non è efficace) (Figura 4), apportando un valore aggiunto al metodo. È inoltre degno di nota il fatto che la tecnologia NeoLux funziona su qualsiasi tipo di modello cellulare eucariotico (animale, vegetale, fungino) e procariotico (batterio).

Caratteristiche

• Per 1000 o 4000 punti di misura in piastre da 96 pozzetti
• Procedura one-step
• Nessun lavaggio
• Procedura standard per la maggior parte delle linee cellulari (se necessario, è disponibile un kit di ottimizzazione)
• Adattabile a linee cellulari, hiPSC, cellule primarie,...
• 1 soluzione nel kit (biosensore da diluire nel terreno di coltura)
• Conservazione a 4°C
• Tempo di esalazione: 6 mesi
• Disponibile anche per piastre da 384 W.

Meccanismo

Il processo è chiamato sistema cellulare light-up perché il livello di fluorescenza del biosensore fluorescente aumenta durante la sua fotoinduzione tramite illuminazione. Il biosensore entra passivamente nelle cellule ma viene rapidamente rimosso dalle cellule funzionali dalle proteine di trasporto di efflusso, dando luogo a un basso segnale fluorescente. Quando viene applicata la luce, la fotoinduzione del biosensore genera ROS intracellulari, che alterano l'omeostasi cellulare o la capacità della cellula di rilasciare il biosensore, innescando il suo ingresso massiccio all'interno delle cellule e determinando un aumento del segnale di fluorescenza. Se le cellule sono state precedentemente incubate con una sostanza tossica, causando un'alterazione dell'efflusso o di altre funzioni cellulari, il biosensore entra massicciamente, determinando un segnale di fluorescenza elevato che non aumenta dopo l'applicazione della luce.

 Sicurezza

Questo prodotto è solo per scopi di ricerca e non per uso umano o terapeutico. Potenzialmente dannoso. Evitare l'esposizione prolungata o ripetuta. Evitare che il prodotto entri negli occhi, sulla pelle o sugli indumenti. Lavarsi accuratamente dopo la manipolazione. In caso di contatto con gli occhi o con la pelle, lavare le aree interessate con abbondante acqua per 15 minuti e consultare un medico. In caso di inalazione o ingestione, spostare l'individuo all'aria aperta e consultare immediatamente un medico.

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