Real-time PCR (polymerasekettingreactie) systemen zijn essentiële instrumenten in de moleculaire biologie, waarmee nucleïnezuren met hoge precisie en snelheid kunnen worden versterkt en gekwantificeerd. Deze systemen bestaan uit meerdere belangrijke componenten die samenwerken om de detectie van specifieke DNA- of RNA-sequenties in real time mogelijk te maken.

Belangrijke componenten van real-time PCR-systemen

1. Reactiemodule: Dit is het kernonderdeel waar de PCR plaatsvindt. Het vereist nauwkeurige temperatuurregeling voor denaturatie van DNA, aanhechting van primers en extensie door DNA-polymerase. De meeste systemen gebruiken Peltier-elementen voor snelle temperatuurveranderingen, wat een uniforme verdeling over alle wells garandeert – essentieel voor nauwkeurige en reproduceerbare resultaten.
2. Optisch detectiesysteem: Real-time PCR-systemen hebben een optisch systeem dat de fluorescentie meet die tijdens de amplificatie vrijkomt. Dit gebeurt met fluorescerende kleurstoffen of probes die zich specifiek aan het doel-DNA binden. Naarmate de PCR vordert, correleert de toename van fluorescentie met de hoeveelheid doel-nucleïnezuur. Geavanceerde systemen bieden multiplexing via meerdere fluorescentiefilters, waarmee meerdere doelen tegelijk kunnen worden gedetecteerd.
3. Instrumentsoftware: De bijbehorende software bedient het systeem, bewaakt de reacties en analyseert de data. Ze bevat doorgaans functies voor het instellen van experimenten, interpreteren van resultaten en exporteren van gegevens. Sommige systemen hebben ingebouwde interfaces om autonoom te werken, zonder aangesloten computer.
4. Fluorescerende kleurstoffen/probes: De keuze van de kleurstof of probe is cruciaal voor specificiteit en gevoeligheid. Veelgebruikte opties zijn SYBR Green en probes zoals TaqMan of Molecular Beacon, die fluoresceren bij binding aan hun doel. Multiplexing wordt mogelijk door gebruik van kleurstoffen met verschillende emissiegolflengten.
5. Monstercapaciteit en configuratie: Real-time PCR-systemen zijn verkrijgbaar in diverse configuraties, meestal met 96-wellplaten voor toepassingen met hoog volume. Geavanceerde modellen bieden flexibele indelingen voor uiteenlopende experimentele behoeften.

Toepassingen

Real-time PCR-systemen worden veel gebruikt in klinische diagnostiek, genexpressieonderzoek, en genetische variatiestudies in de landbouw en milieuwetenschappen. Hun vermogen om snel kwantitatieve gegevens te leveren maakt ze onmisbaar bij toepassingen die directe resultaten vereisen.