NeoLux; Viability assessment by loss of efflux protein function

De gepatenteerde NeoLUX-technologie is een levensceltest die de toestand van homeostase of celschade meet door middel van fluorescentie-uitlezing. De technologie is geoptimaliseerd voor een hoge verwerkingscapaciteit op 96- en 384-wellsplaten, geschikt voor commerciële fluorescentielezers volgens een zeer eenvoudig protocol dat beperkt is tot de toevoeging van de fluorescente marker in het kweekmedium en twee fluorescentiemetingen.

De NeoLUX technologie is gebaseerd op foto-inductie van een biosensor die leidt tot een fluorescentiesignaal. Deze fluorescentietoename wordt alleen waargenomen bij cellen in homeostase voorafgaand aan de toevoeging van de biosensor. Berekening van de fluorescentieverhoudingen voor en na toediening van de LED leidt tot een nauwkeurige en dosisafhankelijke meting van de toestand van cellulaire schade als gevolg van chemische of fysische toxiciteit geïnduceerd door het monster.

NeoLux testmethode Principe

De experimentele procedure is eenvoudig. De TO biosensor wordt toegevoegd aan het celkweekmedium en wordt fluorescerend na associatie met de cel nucleïnezuren. Wanneer TO door LED-verlichting bij 480 nm wordt geactiveerd, gaat de ontspanning gepaard met een energieoverdracht naar het intracellulaire zuurstofmolecuul (3O2), wat resulteert in de productie van singlet zuurstof (1O2) en een cascade van Reactieve Zuurstofspecies (ROS), waaronder superoxide anion (O2.-) en hydroxylradicaal (OH.) (zie fig. 1). Het antioxidatieve effect van een stof kan vervolgens worden gemeten aan de hand van het vermogen om deze intracellulaire ROS-productie tegen te gaan.

Dosis-effect curven 

Het intracellulaire antioxidatieve effect blijkt uit een tijdsvertraging in de fluorescentietoename die wordt veroorzaakt door de LED-afhankelijke fotoactivatie van TO. Figuur 2 illustreert de fluorescentieprofielen van menselijke HepG2-cellen die 4 uur behandeld zijn met verschillende concentraties resveratrol. Resveratrol is een krachtige cellulaire antioxidant waarvan bekend is dat hij actief is als ROS-vanger en als inducer van de natuurlijke celafweer die wordt aangestuurd door de Nrf2 pathway. De controlecurve (niet behandeld) wordt in zwart weergegeven. Verschillen tussen controle en monster Area Under Curves (AUC) maken het mogelijk om een index vast te stellen die het intracellulaire antioxidatieve effect van het monster kwalificeert.

EC50's en andere parameters die antioxidante effecten onthullen

Berekening van de NeoLux index bij verschillende concentraties van het monster maakt het mogelijk om dosis-effectprofielen op te stellen die goed passen bij sigmoïde regressie, waardoor de EC10 (Efficacy Concentration 10%, drempel van cellulair effect), de standaard EC50 (Efficacy Concentration 50%) en de EC90 (Efficacy Concentration 90%, zwakste dosis waarbij de verbinding een maximaal effect heeft) kunnen worden geëvalueerd. Figuur 3 illustreert een voorbeeld van dosis-effect curven verkregen na behandeling met resveratrol gedurende 1 en 4 uur op humane HepG2 cellen.

NeoLux: een veelzijdige testmethode

Meer in het algemeen geven NeoLux fluorescentie profielen informatie over verschillende parameters die specifiek zijn voor het geteste monster en het gekozen celmodel. Naast het antioxidante effect dat hierboven is beschreven, belicht de NeoLux test ook pro-oxidante effecten (linker verschuiving van het monsterprofiel) en cytotoxische effecten (initiële fluorescentie is hoog en de verlichting blijft niet effectief) (figuur 4), wat de methode een toegevoegde waarde geeft. Het is ook opmerkelijk dat de NeoLux technologie werkt op alle soorten eukaryotische (dierlijk, plantaardig, schimmel) en prokaryotische (bacteriën) celmodellen.

Kenmerken

• Voor 1000 of 4000 meetpunten in 96-well platen
• Eenstaps procedure
• Geen wassen
• Standaardprocedure voor de meeste cellijnen (optimalisatiekit beschikbaar indien nodig)
• Aangepast aan cellijnen, hiPSC's, primaire cellen, ...
• 1 oplossing in de kit (biosensor te verdunnen in het kweekmedium)
• Opslag bij 4°C
• Tijd tot expiratie: 6 maanden
• Ook beschikbaar voor 384-w platen.

Mechanisme

Het proces wordt light-up celsysteem genoemd omdat het fluorescentieniveau van de fluorescerende biosensor toeneemt tijdens de foto-inductie door verlichting. De biosensor komt passief de cellen binnen, maar wordt snel uit functionele cellen verwijderd door efflux-transporteiwitten, wat resulteert in een laag fluorescentiesignaal. Wanneer het licht wordt toegepast, genereert de foto-inductie van de biosensor intracellulaire ROS'en die de celhomeostase of het vermogen van de cel om de biosensor vrij te geven veranderen, waardoor de biosensor massaal de cellen binnendringt, wat resulteert in een verhoogd fluorescentiesignaal. Als cellen eerder geïncubeerd zijn met een toxische stof, waardoor de efflux of andere cellulaire functies veranderd zijn, komt de biosensor massaal binnen, wat leidt tot een hoog fluorescentiesignaal zonder toename na toediening van licht.

 Veiligheid

Dit product is alleen bedoeld voor onderzoeksdoeleinden en niet voor menselijk of therapeutisch gebruik. Mogelijk schadelijk. Vermijd langdurige of herhaalde blootstelling. Vermijd aanraking met de ogen, huid of kleding. Grondig wassen na het hanteren. Bij contact met ogen of huid, de getroffen gebieden 15 minuten met veel water spoelen en een arts raadplegen. In geval van inademen of inslikken, de persoon in de frisse lucht brengen en onmiddellijk een arts raadplegen.

Lijst van producten