I. Materiais necessários
Reagentes
- Um (ou mais) anticorpo(s) polar(es) acoplado(s) ou desacoplado(s) específico(s) para a(s) sua(s) molécula(s) de interesse
- Um anti-CD16/32, bloqueia a ligação Fc que se liga ao anticorpo primário de forma específica
- Um anticorpo secundário, no caso de marcação indirecta com um Ac primário não acoplado
- Um (ou mais) isótipo(s) de controlo não relevante(s) do mesmo isótipo e acoplamento que o anticorpo primário

Tampões
- Um tampão de coloração para citometria de fluxo
- Azul de tripano para contagem de células
- Líquido de revestimento para citómetro de fluxo

Material - Pipetas e Pipet-aid
- Uma centrifugadora
- Um frigorífico ou gelo
- Um citómetro de fluxo


II. Duração da experiência
- 30 min de preparação de amostras e anticorpos (diluições)
- 30 min a 1 h de incubação do anticorpo, dependendo da estratégia utilizada (marcação directa ou indirecta)
- 30 min a 1 h de leitura das células pelo citómetro de fluxo (dependendo do número de amostras, da concentração de células e das definições do citómetro)
- TOTAL: 2 a 3 horas


III. Como funciona
- Diluir o anticorpo primário e o isótipo de controlo em 50 µl de tampão de reacção para obter a concentração desejada, previamente validada por titulação (idêntica para ambos os anticorpos)
- Incubar 50 µl da preparação de células com 50 µl da preparação de anticorpos Iaire ou de controlo do isótipo numa placa de 96 poços com fundo em U
- Agitar suavemente a placa e incubar durante 15-30 minutos a 4°C no escuro

Nota: Os anticorpos têm diferentes afinidades com o seu antigénio e requerem diferentes tempos de incubação que devem ser previamente optimizados.

- Adicionar 200 µl de tampão de reacção para parar a reacção
- Centrifugar a suspensão de células durante 5 minutos (300 - 400 g) a +4°c e remover o sobrenadante.
- Repetir as lavagens celulares duas vezes com 200 µl de tampão de reacção e centrifugar a suspensão celular durante 5 min (300 - 400g) a 4°c

Opcional: Em caso de marcação indirecta, repetir os passos de marcação com o anticorpo secundário com o mesmo protocolo e observações
- Ressuspender em 500 µl de tampão de reacção ou de tampão de fixação de formaldeído a 2%
- Ler as células marcadas no citómetro de fluxo


IV. Motores de pesquisa
- Anticorpos primários
- Anticorpos secundários, no caso de marcações indirectas com um Ac Iaire não acoplado